Erektil Disfonksiyonda Gen Tedavisinin Yeri

Dr.Mustafa Faruk Usta, /Tulane University, School of Medicine, Department of Urology, Section of Andrology, New Orleans, LA, USA
Erektil disfonksiyon (ED) basarili bir cinsel iliski icin gerekli olan penil ereksiyonun saglanamamasi ya da devam ettirilememesi olarak tanimlanmaktadir (1). 1995 yilinda, tum dunyada yaklasik olarak 153 milyon erkegin ED problemi oldugu ve bu sayinin 2025 yilinda 322 milyonu bulacagi bildirilmistir (2). Onceleri daha cok psikojenik nedenlere baglanan ED probleminin, gunumuzde yuksek oranda organik nedenlere bagli olarak ortaya ciktigi bilinmektedir. Bunun disinda gecirilmis pelvik travma ve pelvic cerrahiler de (radikal sistektomi ve prostatektomi) vaskuler ve noral yaralanmalara neden olduklari icin ED’a sebep olabilirler (3). Genel olarak ateroskleroz, hipertansiyon ve diabetes mellitus (DM) gibi vaskuler risk faktorleri ile, Peyronie hastaligi ve kronik bobrek yetmezligi, ED’ye eslik eden baslica patolojilerdir

1980’li yillardan sonra erektil fizyoloji ve farmakoloji ile ilgili bilgilerde onemli gelismeler saglanmistir. Ozellikle korpus kavernozum duz kas hucre fizyolojisi konusunda yapilan molekuler calismalar ve erektil fizyolojide rolu olan mediatorlerin gosterilmesi, ED’u tedavi edebilecek farmakolojik ajanlarin gelistirilmesine buyuk katki saglamistir. Gunumuzde ED’un tani ve tedavisinde saglanan gelismelerin tum hastalarin tedavilerine olanak saglayacak duzeye geldigini gormekteyiz. Vakum ereksiyon cihazlari, intrakavernozal enjeksiyon tedavisi, intraurethral supozituvarlar, oral farmakolojik ajanlar, penil vaskuler cerrahi prosedurleri ve penil protez implantasyon tedavileri; ED problemi olan hastalara en uygun tedavi opsiyonu olanagini saglamaktadir. Tum bunlara karsilik, bu tedavi yontemlerinin; degisik oranlarda yan etki, komplikasyon ve kontrendikasyonlari soz konusudur. Bundan dolayi ED’nin geleceginde yer almasi olasi tedavi yontemlerinin, daha az oranda yan etki gostermesi ve minimal invaziv olmasi beklenmektedir. Bu baglamda, ED’nin tedavisinde yeni bir modalite olarak gen terapi ve growth faktorlerinin kullanimi guvenle uygulanabilir, minimal invaziv yontemler olarak gorulmektedir (4).
Penil Ereksiyonun Fizyolojisi:
ED tedavisinde gene terapinin hedefini ve rolunu anlayabilmek icin oncelikle normal ereksiyon fizyolojisini kisaca hatirlamak gereklidir. Normal erektil fonksiyonu olusmasinda sinerjik ve simultane olarak calisan 3 adet prosese ihtiyac vardir: 1) norolojik yolla uyarilan artmis arteriyel kan akimi, 2) kavernozal duz kas relaksasyonu, 3) venoz donus akiminin kisitlanmasi.
ED bu yollardan herhangi birinde olusan yetersizlige bagli olarak ortaya cikmaktadir (5). Bilindigi gibi penis, uc anatomik kompartimandan olusmaktadir. Korpus spongiozum penisin ventral yuzu boyunca uretrayi desteklemekte ve korumaktadir. Buna karsilik dorsalde yer alan ve birbirine komsu iki bolumden olusan korpus kavernozum ereksiyon aninda kan ile dolarak penil ereksiyonu saglamaktadir. Kavernozal kompartiman helicin arterler tarafindan beslenen, vaskuler sinuslerin teskil ettigi yaygin bir ag yapisindan olusmaktadir.  Penis flask haldeyken vaskuler sinusleri destekleyen duz kas hucreleri tonik olarak kontrakte durumdadir ve bu durum dusuk duzeyde kan dolasimina izin vermektedir. Buna karsilik, seksuel stimulasyonlara yanit olarak ortaya cikan ve kavernozal sinir terminalleri ile endoteliyumdan olusan noromediator salinimi, kavernozal duz kaslarin relaksasayonuna ve sonuc olarak da penil ereksiyona neden olmaktadir.
Penis otonomik ve somatic sinirler tarafindan innerve edilmistir. Kolinerjik sinirler, nonadrenerjik/nonkolinerjik sinirler (nitric oksit), Vazo-Intestinal Polipeptid (VIP) ve Calsitonin Gene Related Peptid (CGRP) gibi diger bazi faktorler duz kas relaksasyonuna neden olmaktadir (5,6). Bunun disinda, shear stres ve trabekuler endoteliyumda yer alan muskarinik reseptorlerde nitric oksit produksiyonunu stimule etmektedir. Nitrik oksit duz kas hucrelerine diffuse olmakta ve guanilat siklaz ile etkilesime gecerek hucre ici cGMP duzeylerini arttirmaktadir. cGMP duzeylerinin yukselmesi de duz kas relaksasyonu ile sonuclanan ve cGMP ye bagli protein kinaz ve iyon kanallari yoluyla etki eden selluler proseslere neden olmaktadir. Bu mekanizma, intracellular Ca(+2) duzeylerinin azalmasi ve duz kas hucre hiperpolarizasyonuna neden olan Potasyum iyon kanallarinin acilmasina neden olmaktadir (7,8,9). Benzer sekilde; VIP, CGRP ve Prostoglandin araciligi ile olan yollar da hucre ici cAMP duzeylerini arttirmak yoluyla duz kas hucre relaksasyonuna sebep olmaktadir (10). Tum bu ereksiyon mekanizmalari icinde cok onemli olan ve mutlaka hatirlanmasi gereken bir ozellik de gap junction olarak bilinen ve kavernozal duz kas hucre membraninda yer alan iyon kanallaridir. Siki bir komunikasyona neden olan bu kanallar sayesinde, erektil fizyolojide cok onemli bir rolu olan sinsisyal relaksasyon ve kontraksiyon ortaya cikabilmektedir (9)
Gen terapi ve Erektil Disfonksiyon:
Somatik gen transferi: tedavi saglamak amaciyla, uygun tipte hucreye in vivo ya da in vitro yollardan, o hucrenin gen expresyonunda degisiklige neden olacak gen materyeli (RNA ya da DNA) nakledilmesidir. Gecmiste gen tedavisi ile etyolojisinde genetik hata olan bazi hastaliklarin genetic komponentlerinin tedavisi amaclanmaktaydi. Buna karsilik gunumuzde: teorik olarak herhangi bir fizyolojinin gerceklesmesinde kilit rol oynayan ve cesitli hastaliklarda duzeyleri dustugu bilinen protein ya da faktorlerin gen nakli sonrasi konak hucrelerde uretilmesi ve eksik olan proteinin yerine konulmasi yoluyla ortaya cikacak terapotik etki uzerinde durulmaktadir. Tum bunlarin disinda, bazi mutant gen expresyonlarinin antagonize edilmesi de olanakli olabilmektedir. Ozet olarak: gen tedavisinin basari ile sonuclanmasinda; oncelikle uretimi konak hucre tarafindan yapilmasi hedeflenen proteini kodlayan genin olmasi, hedef genin uygun bir vektor ile konak hucreye nakledilmesi ve konak hucrenin nakledilen genetik mayteryel ile negatif etkilesime girmemesi gereklidir (4).
Gen nakli Metodlari: Basarili bir gen tedavisinin en onemli sartlarinda biri: transfer edilecek olan genetic materyel (RNA ya da DNA)’in  en etkin tedaviyi saglayacak uygun vector ya da arac ile tasinmasidir. Gunumuze kadar kullanilmis olan bazi vektorler: nonviral vektorler (ciplak DNA, plasmid DNA, ve lipozomlar), adenovirusler, adeno-associated virusler ve retrovirusler olarak siralanabilir. Tum bu vektorlerin kendine ozgu etkinlik ve konak hucrede yan etki olusturma ozellikleri bulunmaktadir. Ideal bir vector: etkili bir transduksiyonu ve uzun sureli gen ekspresyonu saglayan, enfeksiyon, immunolojik reaksiyon ve konak hucre mutasyonu gibi yan etkileri cok az ya da hic gostermeyen ozelliklerde olmalidir (4). Gunumuzde yapilan calismalar sonucunda, tum bu ozelliklere sahip ideal bir vektorun henuz bulunamamistir. Ciplak DNA, plasmid DNA ve lipozomlar hemen hemen hic yan etkiye sahip olmadiklari halde dusuk transfer ve ekspresyon oranlari nedeniyle gunumuzde ideal bir vektor olarak gorulmemektedir. Buna karsilik viral vektorlerin; yuksek tedavi etkinligi, uzun sureli doku ekspresyonu gibi istenen ozelliklere sahip olmakla birlikte, konak hucrede minimal duzeyde de olsa sebep olduklari immunolojik yanit nedeniyle kullanimlari konusunda bazi kuskular bulunmaktadir.
ED tedavisinde gen terapi: Oncelikle gen tedavisini erektil disfonksiyon tedavisinde uygulanabilir bir tedavi yontemi olup olmadiginin ele alinmasi gereklidir. Gen tedavisi baslangicta kardiyovaskuler hastaliklarin tedavisinde uygun bir tedavi opsiyonu olarak onerilmistir (11). Bu baglamda, ED’nin etyolojisinde rol oynayan en onemli nedenlerin basinda vaskuler patolojilerin yer almasi, ayni yontemin ED tedavisinde de kullanilabilecegini dusundurmustur. Kardiyovaskuler sistemin yapisal ozelligi nedeniyle bu sistemin hastaliklarinin tedavisinde: gen terapinin hedeflenen bolge disina rahatlikla ulasmasi gibi bir sakinca bulunmaktadir. Buna karsilik ED tedavisinde benzer bir sakinca minimal duzeye indirilebilmektedir. Penisin kokune uygulanacak basit bir turnike sayesinde, gen enjeksiyonunun ardindan olusabilecek olasi sistemik etkinin minimale indirilmesi saglanabilir. Gen tedavisi ile ilgili bir baska problem de: tedavi etkinliginin saglanmasinda hedeflenen hucrelerin buyuk kisminin transfekte edilmesi gerekliligidir. Buna karsilik penisde sadece belli bir grup hucrenin transfekte olmasi terapotik etkinin saglanmasinda yeterli olmaktadir. Bilindigi gibi korpus kavernozum duz kas hucrelerinin arasinda gap junctionlar tarafindan saglana interkonneksiyon agi mevcuttur. Belli bir hucrede gen nakli sonrasi saglanan terapotik etki, bu konneksiyonlar sayesinde, tum hucreler transfekte edilmis gibi penis boyunca yayilabilmektedir. Christ, gap junction yapilarinin iyon ve sekonder habercilerin exchange’ine olanak sagladiklarini, bunun da noronal aktivasyon olmaksizin hucreler arasi komunikasyonlar sayesinde korpus kavernozum duz kasinin active olmasina olanak sagladigini bildirmislerdir (9). Tum bunlarin disinda korpus kavernozum duz kas hucrelerinin rolatif olarak dusuk turn-over oranlarina sahip olmalari da tedavi edici genin uzun sureli olarak hedef hucrede eksprese olmasina neden olmaktadir.
Erektil fizyolojinin prensibi: korpus kavernozumda yer alan arteriyel ve duz kas hucrelerinin relaksasyon/kontraksiyon dengesini dayanmaktadir (5,6). Bu hassas dengede rol oynayan onemli molekullerin en dusuk duzeylerde yetersizligi ya da eksikligi ED ile sonuclananabilecek bir prosese neden olacaktir. Bu gercekten yola cikarak, cesitli organik bozukluklarin eksikliginde ortaya cikan ve fizyolojide rolu olan urunlerin, gen nakli ardindan konak hucre tarafindan uretilmesi ve terapotik etkinin saglanmasi, gen tedavisinin temel prensibi olarak gorulmektedir. Bu prensibin sonucu olarak: gunumuze kadar yapilan tum bilimsel calismalarda da erektil fizyolojide onemli rol oynayan proteinlerin gen nakli yoluyla yerine konulmasi ve olusan fizyolojik ve biyokimyasal degisikliklerin arastirilmasi amaclanmistir.
ED tedavisinde  gunumuze kadar kullanilan genler:
Duz kas relaksasyonu normal bir ereksiyonun saglanmasinda gerekli olan en onemli basamaktir. Bundan dolayi, duz kas hucre relaksasyonunu saglayan sinyal-transduksiyon yoluna etki eden molekul ve enzimler, ED’nin gen tedavisinde onemli hedefler olarak gorulmektedir. Bu konu ile ilgili ilk gen tedavisi Garban ve arkadaslari tarafindan gerceklestirilmistir. 1997 yilinda yayinlanan bu calismada: iNOS geni ile kodlanmis ciplak DNA molekulunun yasli ratlarda erektil fonksiyon uzerine iyilestirici etkisi gosterilmistir (12). Ayni donemlerde Rehman tarafindan nNOS ile kodlanmis ciplak DNA molekulunun de kontrol grubu ile karsilastirildiginda yasli rartlarda intrakavernozal basinc degerleri uzerine olan olumlu etkisi gosterilmistir (13). Sonralari Christ ve arkadaslari, maksi-K kanallarini kodlayan hSlo cDNA naklinin yasli ve diabetik ratlarda erektil disfonksiyon uzerine olan terapotik etkisini bildirmislerdir (14). Wessels 1999 yilinda, genetik olarak modifiye edilebilen endotelial hucrelerin rat korpus kavernouzuma nakledildikten sonra, yaklasik olarak 2 hafta sureyle hic bir degisime ugramadan eksprese edilebildigini ve konak hucrede de herhangi bir degisikligin ortaya cikmadigini gostermistir (15).
2000’li yillara gelindiginde ED’nin tedavisinde gen terapi ile yapilan calismalarin onemli bir ivme kazandigi goze carpmaktadir. Bu konuda yapilan en onemli calismalardan birinde Bakircioglu ve arkadaslari: norojenik ED olusturulan ratlarin, korpus kavernozuma Adeno Associated Virus (AAV)-Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) enjeksiyonu ile tedavi edilebildigi gosterilmislerdir. Bu calismanin sonucunda, BDNF gen tedavisinin major pelvic ganglionda nNOS sentezleyen noronlarin dejenerasyonunu engelledigi ve penil dokuda yine nNOS sentezleyen noronlarin rejenere ettigi dusunulmustur (16). Yakin zamanda Lee ve arkadaslari da travmatik arteriojenik ED olusturulan ratlarda erektil fonksiyonun, kavernozal dokuya Vaskuler Endothelial Growth Faktor (VEGF) nakli yapilmak suretiyle geri dondurulebildigini gostermislerdir (17). Magee ve arkadaslari ise yasli ratlarin penislerine Adenovirus (AV)-nNOS gen nakli yaptiktan sonra, erektil kapasitenin genc ratlarin duzeyine getirilebildigini bildirmislerdir (18).
Tulane Universitesi Tip Fakultesi Deneyimi: Laboratuvarimiz, Birlesik Devletlerde gen tedavisi konusunda bircok calismanin gerceklestiridigi ve halen devam ettirilmekte oldugu onemli merkezlerden biridir. ED’un gen terapi ile tedavisi konusunda hedef aldigimiz ve uzerinde calistigimiz basiklar:
1)      Yasli ratlarin ED tedavisinde endoteliyal nitric oksit sentetaz (eNOS), super oksit dizmutaz (SOD), Kalsitonin gen related peptid (CGRP) gen tedavileri
2)      Diabetik ratlarin tedavisinde eNOS ve dominant negative RhoA gen tedavileri olmak uzere baslica iki grupta ele alinabilir.
Laboratuvarimizda ilk olarak yapilan calismada, Adenovirus yoluyla yapilan eNOS gen naklinin ratlarda yasliliga bagli ortaya cikan ED’u tedavi ettigi gosterilmistir. Bu calismada promotor gen olarak sitomegalovirus ya da rous sarcoma virus promotor bolgeleri kullanilmis ve nakledilen eNOS geninin iki ay sureyle penil dokuda eksprese edilebildigi gosterilmistir. Bu calismada transfeksiyondan 5 gun sonra yapilan erektil fizyoloji degerlendirmelerinde; yasli ratlarda kavernozal sinir stimulasyonuna yanit olarak olusan intrakavernozal basinc artislarinin, genc ratlarla esdeger duzeyde oldugu gosterilmistir. Yasli rat grubunda yer alan ve 1 ay sonra sinir stimulasyonu yapilan ratlarda da benzer neticelerin alinmasi, nakledilen genin 1 ay sureye kadar etkin olarak penil dokuda kalabildigini gostermistir (19).
Bilindigi gibi yaslilikla birlikte penil dokuda superoksit anyon duzeyleri artmakta ve bu molekul nitric oksit (NO) ile etkilesime girmek suretiyle hem doku NO duzeylerini azaltmakta, hem de bu reaksiyon sonucu olusan peroksinitrit duz kas hucrelerinin olumune neden olmaktadir. Yasli ratlarda, artan superoksit anyon duzeylerini azaltmak ve bu yolla erektil fonksiyonu tedavi etmek amaciyla yapmis oldugumuz bir baska calismada: yasli ratlarin penil dokularinda AV-SOD gen transfeksiyonunun etkinligini arastirdik. Yaptigimiz calismada eNOS gen nakli calismasinin sonuclarina benzer olarak SOD geninin penil dokuda 1.5 sureyle eksprese edilebildigini ve erektil fonksiyonun bu tedavi ile kontrol grubunda yer alan ratlarin duzeyine getirilebildigini gosterdik.
Penil dokuda cAMP yoluyla etki ettigi ve yaslilikla birlikte azaldigi bilinen onemli mediyatorlerden biri de CGRP’dir. Yine yasli rat modellerinde yapmis oldugumuz bir baska calismada: yasli ratlara yapilan AV-CGRP gen transfeksiyonu ile cAMP yolu uzerinden erektil kapasitelerin arttirildigi gosterilmistir. Bu calisma sonucunda; daha onceden de kabul edildigi gibi CGRP’in erektil fizyolojideki rolu gosterilmis ve yasli ratlarda olusan ED’nin tedavisinde CGRP gen naklinin alternatif bir tedavi modalitesi olabilecegi dusunulmustur (20).
Diabetik rat modellerinde yapmis oldugumuz gen tedavisi calismalarinda da ilk denedigimiz tedavi modalitesi eNOS gen nakli olmustur. Oncelikle diabetik rat modellerinde eNOS protein duzeyinin kontrol grubuna gore anlamli olarak azaldigi gosterilmis ve ardindan da eNOS gen naklinin diabetik ratlarda ED uzerine olan etkisi arastirilmistir. Calismamiz sonucunda: gen naklinden sonra eNOS gen ekspresyonu penil dokuda arttigi gosterilmis, buna bagli olarak NO ve cGMP duzeylerinin de tedavi sonrasi diabetik dokularda anlamli olarak yukseldigi tespit edilmistir. Yapilan elektrofizyolojik degerlendirmeler sonucunda da eNOS gen naklinin diabetik ratlarda erektil fonksiyon uzerine tedavi edici etkinligini oldugu saptanmikstir (21). Ayni calismanin bir ileri asamasinda; diabetik ratlara eNOS gen nakli ile birlikte sildenafil sitrat tedavisi yapilarak intrakavernozal basinc artislari ile birlikte, ereksiyon surelerinin de diabetik ratlarda uzatilabildigi gosterilmistir. Sonuc olarak: kombine eNOS geni ve sildenafil sitrat tedavisinin gelecekte, tek basina sildenafil tedavisine yanit alinamayan cok sayidaki diabetik ED hastasinin tedavisinde onemli bir alternatif tedavi secenegi olabilecegi dusunulmustur (22).
Daha yakin zamanda, erektil fizyolojide sadece duz kas relaksasyonunu saglayan molekullerin degil, ayni zamanda duz kas kontraksiyonunu saglayan molekullerin de rolunu goz onune alarak, bir baska grup gen tedavisi alternatifi uzerinde durduk. Bu grup calismamizda, Mills ve arkadaslari tarafindan daha onceden bildirilen ve duz kas kontraksiyonu uzerindeki rolu bugun cok iyi bilinen Rho kinase molekulu uzerinde calistik (23). Ilk olarak yaptigimiz calismada Rho kinaz aktivatoru olan RhoA’nin blokoru double negative RhoA mutant (T19NrhA) genini AAV yoluyla rat penis dokularina transfer ettik. Bu calisma sonucunda; gen nakli yapilan grupta etkisiz gen nakli yapilan gruba gore erektil yanitin anlamli olarak arttirildigini gosterdik (24). Ek olarak diabetik ratlarda Rho kinaz gen produksiyonunun penil dokularda arttigi bilgisinden yola cikarak, ayni geni naklettigimiz diabetik ratlarda da erektil yanitin diabetik olup gen nakli yapilmayan gruba gore arttirildigini gosterdik. Bu calisma sonuclari da: diabetik ED tedavisinda AAV-dominant negative RhoA terapisinin gelecektre onemli bir tedavi secenegi olabilecegini dusundurdu (25).
Laboratuvarimizda devam eden en guncel ve sonuclarini daha henuz tamamlamadigimiz bir baska calismada: ex-vivo olarak eNOS geni nakledilmis kemik iligi kaynakli stem cell hucrelerinin yasli ratlarda erektil fonksiyon uzerine olan etkinligini arastiriyoruz. Bu tedavinin, erektil fonksiyon uzerine olumlu sonuclari, genc hucre ve beraberinde gen nakli kombinasyon tedavisinin degisik etyolojilere bagli olarak olusan ED tedavisinde yeni bir alternatif olabilecegini gosterebilecektir.
Tum bu calismalarin sonucunda elde edilen veriler, gen terapinin ED tedavisinde gelecekte umut verici bir yontem olabilecegini dusundurmektedir. Ozellikle penil dokularda uzun sureli gen ekspresyonlarinin gosterilmesi, sadece bir tek enjeksiyon ile yaklasik 2-3 aya kadar varan tedavi etkinliklerinin saglanabilecegini dusundurmektedir. Bununla birlikte experimental calismalarda gorulmemesine karsilik, kullanilan vektorlere bagli olarak ortaya cikabilecek lokal ve sistemik etkiler konusunda kuskular devam etmektedir. Ozellikle bu konuda yapilacak arastirmalardan elde edilecek sonuclar, gen terapinin  insanlarda uygulanmaya baslanma zamaninin belirlenmesinde etkili olacaktir.
KAYNAKLAR:
1-) NIH Consensus Conference. Impotence. NIH Consensus Development Panel on Impotence. JAMA. 270:83-90, 1993
2-) Aytac IA, McKinlay JB, Krane RJ: The likely worldwide increase in erectile dysfunction between 1995 and 2025 and some possible policy consequences. Br J Urol 84:50-56, 1999
3-) Benet AE and Melman A: The epidemiology of erectile dysfunction. Urol Clin North Am 22:699-709, 1995
4-) Bivalacqua TJ and Hellstrom WJG: Potential application of gene therapy for the treatment or erectile dysfunction. J Androl 22:183-190, 2001
5-) Lue TF: Erectile dysfunction. N Eng J Med 342:1802-1813, 2000
6-) Stief CG, Noack T Anderson KE: Signal transduction in cavernous smooth muscle. World J Urol 15:27-31, 1997
7-) Burnett AL, Lowenstein CJ, Breedt DS, Chang TSK, Synder SH: Nitric oxide: physiologic mediator of penile erection. Science 257:401-403, 1992
Rajfer J, Aronson WJ, Bush PA, Dorey FJ, Ignarro LJ: Nitric oxide as a mediator of relaxation of the corpus cavernosum in response to nonadrenergic, noncholinergic neurotransmission. N Eng J Med 326:90-94, 1992
9-) Christ GJ: The “syncytial tissue triad”: a model for understanding how gap junctions participate in local control of penile erection. World J Urol 15:36-44, 1997.
10-) Bivalacqua TJ, Champion HC, Rajasekaran M, Sikka SC, Kadowitz PJ, Doherty PC, Hellstrom WJG: Potentiation of erectile response and cAMP accumulation by combination of prostaglandin E1 and rolipram, a selective inhibitor of the type 4 phosphodiesterase (PDE 4). J Urol 162:1848-1855, 1999
11-) Champion HC, Bivalacqua TJ, D’Sousa FM: Gene transfer of endothelial nitric oxide synthase to the lung of the mouse in vivo. Effect on agonist-induced and flow-mediated vascular responses. Circ Res 84:1422-1432, 1999
12-) Garban H, Marquez D, Magee T, Moody J, Rajavashisth T, Rodriguez JA, Hung A, Vernet D, Rajfer J, Gonzales-Cadavid NF: Cloning of rat and human inducible penile nitric oxide synthase. Application for gene therapy of erectile dysfunction. Biol Reprod 7:93-109, 2000
13-) Rehman J, Christ G, Melman A et aL: Enhancement of physiologic erectile function with nitric oxide synthase gene therapy. J Urol 157:782A, 1997
14-) Christ G, Rehman J, Day N, Salkoff L, Valcic M, Melman A, Geliebter J: Intracorporeal injection of hSlo cDNA in rats produces physiologically relevant alterations in penile function. Am J Physiol 275:H600-H608, 1998
15-) Wessells H, Williams SK: Endothelial cell transplantation into the corpus cavernosum: moving towards cell-based gene therapy. J Urol 162:2162-2164, 1999
16-) Bakircioglu ME, Lin CS, Fan P, Sievert KD, Kan YW, Lue TF: The effect of adeno-associated virus mediated brain derived neurotrophic factor in an animal model of neurogenic impotence. J Urol 165:2103-2109, 2001
17-) Lee MC, El-Sakka AI, Graziottin TM, Ho HC, Lin CS, Lue TF: The effect of vascular endothelial growth factor on a rat model of traumatic arteriogenic erectile dysfunction. J Urol 167; 761-767, 2002
18-) Magee TR, Ferrini M, Garban HJ, Vernet D, Mitani K, Rajfer J, Gonzales-Cadavid NF: Gene therapy of erectile dysfunction in rat with penile neuronal nitric oxide synthase. Biol Reprod 67:20-28, 2002
19-) Bivalacqua TJ, Chamion HC, Mehta YS, Abdel-Mageed AB, Sikka SC, Ignarro LJ, Kadowitz PJ, Hellstrom WJG: Adenoviral gene transfer of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) to the penis improves age related erectile dysfunction in the rat. Int J Imp Res 12 Suppl 3:8-17, 2000
20-) Bivalacqua TJ, Champion HC, Abdel-Mageed AB, Kadowitz PJ, Hellstrom WJG: Gene transfer of prepo-calcitonin gene-related peptid restores erectile function in the aged rat. Biol Reprod 65:1371-1377, 2001
21-) Bivalacqua TJ, Usta MF, Champion HC, Kadwitz PJ, Hellstrom WJG: Gene transfer  of endothelial nitric oxide synthase partially restores nitric oxide synthesis and erectile function in streptozotocin dxiabetic rats. J Urol (Basimda)
22-) Bivalacqua TJ, Usta MF, Champion HC, Leungwattanakij S, Dabisch P, Kadowitz PJ, Hellstrom WJG: Effect of combination of endothelial nitric oxide synthase gene therapy and sildenafil on erectile function in diabetic rats. Int J Imp Res (Basimda)
23-) Mills TM, Chitaley CJ, Wingard RW, Lewis RW, Webb RC: Effect of Rho-kinase inhibition on vasoconstruction in the penile circulation. J Appl Physiol 91:1269-1273, 2001
24-) Chitaley CJ, Bivalacqua TJ, Champion HC, Usta MF, Hellstrom WJG, Mills TM, Webb RC: Adeno-associated viral gene transfer of dominant negative Rho A enhances erectile function in rats. Biochem Biophys Res Com 298:427-432, 2002
25-) Bivalacqua TJ, Usta MF, Chitaley CJ, Champion HC, Webb RC, Lewis RW, Mills TM: Adeno-associated viral gene transfer of dominant negative RhoA improves erectile function in streptozotocin diabetic rats. Biochem Biophys Res Com (Basimda)